تولید متالوپروتئیناز ۶۳ کیلو دالتونی (gp۶۳) لیشمانیا ماژور در مخمر متیلوتروف pichia pastoris
نویسندگان
چکیده
سابقه و هدف: با توجه به مشکلات ناشی از لیشمانیا به عنوان یک انگل داخل سلولی بیماریزا که بیش از 12 میلیون نفر را در بیش از 86 کشور جهان مبتلا نموده است و در راستای ارزیابی توانایی گلیکوپروتئین 63 کیلودالتونی (gp63) لیشمانیا ماژور به عنوان یک ایمنوژن در تحریک سیستم ایمنی میزبان و همچنین آنتی ژن تشخیصی، ژن کد کننده مولکول فوق در وکتور دو میزبانه phil-s1 به منظور بیان آن ژن در مخمر متیلوتروف p.pastoris کلون و بیان گردید و در نهایت خصوصیات مولکول نوترکیب حاصل نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. مواد و روش ها: ژن تغییر یافته gp63 به گونه ای که فقط پروتئین بالغ راکد نماید، در وکتور دو میزبانه (و همچنین پلاسمید puc19) کلون گردید. مخمر pichia pastoris (سویه های km71 و gs115) با پلاسمید دو میزبانه نوترکیب و همچنین با پلاسمید phil-s1 (به تنهایی) ترانسفورم گردید. کلون های ترانسفورم شده در محیط فاقد هیستیدین انتخاب شدند، dna کروموزومی ترانسفورمنت ها تخلیص گردید و با روش های pcr و s.b) southern blotting)، وارد شدن ژن فوق در کروموزوم مخمر نوترکیب مورد ارزیابی قرار گرفت. ترانسفورمنت های تایید شده، در محیط حاوی گلیسرول bmgy، تا حصول کدورت od600=6 کشت و سپس جهت بیان ژن هترولوگ فوق به محیط حاوی متانول، bmmy، انتقال داده شدند. با افزودن متانول به صورت روزانه، حالت القا در آنان حفظ گردید. با تخلیص ran و انجام n.b) northern blotting) صحت نسخه برداری و همچنین بیان ژن فوق (تولید پروتئین نوترکیب) با ژل 12% sds-page، وسترن بلاتینگ و ifa مورد ارزیابی قرار گرفت. میکروسکوپ الکترونی و ایمونوالکترون میکروسکپی برای تعیین محل داخل سلولی گلیکوپروتئین هترولوگ rgp63، در مخمر بیان کننده ژن فوق مورد استفاده قرار گرفتند. فعالیت متالوپروتئیناز نوترکیب (rgp63) و همچنین تاثیر بازدارنده های آنزیمی با sds-page gelatin مطالعه گردید، توانایی مخمر در گلیکوزیلاسیون متالوپروتئیناز نوترکیب (rgp63) نیز سنجش گردید. یافته ها: pcr و (s.b) وارد شدن ژن gp63 را به گونه ای صحیح در کروموزوم مخمر نوترکیب تائید کردند. (n.b) بر روی rna تخلیص شده از مخمر نوترکیب صحت نسخه برداری از ژن gp63، ژل 12% sds-page و وسترن بلاتینگ نیز، بیان ژن فوق (تولید پروتئین نوترکیب) را در مخمر ترانسفورمنت تائید نمودند. مطالعه با sds-page gelatin gel، فعال بودن مولکول فوق را اثبات نمود. یدواستامید و edta با غلظت 5 میلی مولار از فعالیت این مولکول در ژل مزبور ممانعت نمودند. بررسی ها با میکروسکوپ الکترونی وجود ناحیه پروتئینی متراکم را در فضای پریپلاسمی مخمر ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن نشان داد. بررسی های ایمونوالکترون میکروسکوپی و ifa نیز تایید نمودند که ناحیه پروتئینی فوق، همان پروتئین نوترکیب (rgp63) می باشد. آزمون pngase-f نیز گلیکوزیله بودن باندهای بیش از 53 کیلودالتونی آن را اثبات نمود. نتیجه گیری: گلیکوپروتئین 63 کیلودالتونی تولید شده در مخمر به فرم طبیعی خود بیشتر شباهت دارد، زیرا علاوه بر گلیکوزیله بودن در sds-page gelatin gel نیز فعال می باشد
منابع مشابه
تولید متالوپروتئیناز 63 کیلو دالتونی (gp63) لیشمانیا ماژور در مخمر متیلوتروف Pichia pastoris
سابقه و هدف: با توجه به مشکلات ناشی از لیشمانیا به عنوان یک انگل داخل سلولی بیماریزا که بیش از 12 میلیون نفر را در بیش از 86 کشور جهان مبتلا نموده است و در راستای ارزیابی توانایی گلیکوپروتئین 63 کیلودالتونی (gp63) لیشمانیا ماژور به عنوان یک ایمنوژن در تحریک سیستم ایمنی میزبان و همچنین آنتی ژن تشخیصی، ژن کد کننده مولکول فوق در وکتور دو میزبانه pHIL-S1 به منظور بیان آن ژن در مخمر متیلوتروف P.past...
متن کاملجداسازی و کلونینگ ژن فولیکول استیمولایتینگ هورمون انسانی hFSH با سیگنال سکانس طبیعی ژن در شاتل وکتورpPIC9 مخمر متیلوتروف Pichia pastoris
سابقه و هدف: فولیکول استیمولاتینگ هورمون (FSH) از خانواده هورمون‌های گلیکوپروتئینی هیپوفیز و متشکل از دو زیرواحد آلفا و بتا می‌باشد که فعالیت بیولوژیک این هورمون مربوط به زیرواحد بتای آن است. این مطالعه به منظورجداسازی ناحیه کدکننده ژن انسانی FSHβ با سیگنال سکانس طبیعی ژن و کلونینگ آن در شاتل وکتورpPIC9 تحت پروموتر AOX1 و سیگنال سکانس آلفا فاکتور انجام شد. مواد و روش‌ها: طی دو مرحله امپلیفیکا...
متن کاملطراحی و ساخت وکتور بیانی جدید در مخمر pichia pastoris دارای پروموتر القایی fmd وتوالی histag
عنوان: طراحی وساخت وکتور بیانی جدید در مخمر pichia pastoris دارای پروموتر fmd سلول های مخمری با توجه به میزان بیان بالا و سرعت رشد مناسب، میزبان های ایده آلی برای تولید پروتئین های نوترکیب در صنعت محسوب می شوند. از مخمرهای صنعتی می توان به مخمر متیلوتروف pichia pastoris اشاره کرد. اغلب برای بیان پروتئین نوترکیب در مخمر p. pastoris از پروموتر قوی و القایی aox1 استفاده می شود. یکی از مشکلات استف...
مروری بر روش های تولید پروتئین های نوترکیب درمانی در مخمر پیشیا پاستوریس
موفقیت سیستم های بیانی مخمر برای بیش از 20 سال جهت تولید پروتئین های نوترکیب امری اثبات شده است. استفاده از مخمر متیلوتروف pastoris Pichia به عنوان یک میزبان سلولی جهت بیان پروتئین های نوترکیب در صنعت دارویی طی سالهای اخیر رشد چشم گیری داشته است. سیستم بیانی مخمر pastoris Pichia با دارا بودن مزایایی چون دستکاری ژنتیکی آسان، تراکم سلولی بالا نسبت به سلول های پستانداران، دارا بودن پتانسیل بالا جه...
متن کاملSynthetic Core Promoters for Pichia pastoris
Synthetic promoters are commonly used tools for circuit design or high level protein production. Promoter engineering efforts in yeasts, such as Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris have mostly been focused on altering upstream regulatory sequences such as transcription factor binding sites. In higher eukaryotes synthetic core promoters, directly needed for transcription initiation by R...
متن کاملPichia pastoris "just in time" alternative respiration.
Alternative oxidases (Aox or Aod) are present in the mitochondria of plants, fungi and many types of yeast. These enzymes transfer electrons from the ubiquinol pool directly to oxygen without contributing to the proton transfer across the mitochondrial membrane. Alternative oxidases are involved in stress responses, programmed cell death and maintenance of the cellular redox balance. The altern...
متن کاملمنابع من
با ذخیره ی این منبع در منابع من، دسترسی به آن را برای استفاده های بعدی آسان تر کنید
عنوان ژورنال:
کومشجلد ۳، شماره ۱، صفحات ۶۹-۸۲
کلمات کلیدی
میزبانی شده توسط پلتفرم ابری doprax.com
copyright © 2015-2023